HPLC法測定清顆粒中黃芩苷的含量實驗

一、實驗目的及背景
    建立液相色譜法測定一清顆粒中黃芩苷的含量。
方法：采用Hypersill C18（250×4.6mm，5μm）色譜柱，以甲醇－0.2mol/L磷酸二氫鈉緩沖液（用磷酸調節pH值至2.7）（42：58）為流動相；流速為1.000mL/ moL，檢測波長275nm，柱溫29℃。
結果：黃芩苷在0.0916～0.7608μg范圍內成良好的線性。（r=0.9945），平均回收率98.9%，RSD=0.31%。
結論：方法簡便、快速、適用性好，可用于該制劑的質量控制。
    一清顆粒是中藥復方制劑，黃褐色；味微甜、苦。由黃連 ，大黃 ，黃芩共 3味中藥組成，具清熱瀉火解毒，化瘀涼血止血。用于火毒血熱所致的身熱煩躁，目赤口瘡，咽喉、牙齦腫痛，大便秘結，吐血，咯血，衄血，痔血等癥；咽炎，扁桃體炎。為了更有效的控制制劑質量，采用液相色譜法對該制劑中黃芩苷進行了含量測定，為該制劑的生產提供了質量控制依據。

二、儀器與試藥
    液相色譜儀，Breeze工作站。甲醇為色譜純，水為純化水，其余試劑為分析純。黃芩苷對照（中國藥品生物制品檢定所，批號為110715-200212），一清顆粒。  

三、方法與結果
1、色譜條件與適用性試驗
   色譜柱：Hypersil  C18（250×4.6mm，5μm），檢測波長為275nm。流動相：甲醇－0.2mol/L磷酸二氫鈉緩沖液（用磷酸調節pH值至2.7）（42：58），理論塔板數按黃芩苷計算，應不低于5000。
2、對照品溶液制備
   精密稱取在105℃干燥至恒重的黃芩苷對照品12.5mg，置250ml量瓶中，用少量甲醇溶解，用重蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得（每1ml中含黃芩苷50μg），即得。
3、供試品溶液的制備
   取本品裝量差異項下的內容物，混勻，研細，取約0.75g，精密稱定，置100ml量瓶中，加甲醇10ml，超聲處理10分鐘，用重蒸餾水稀釋至刻度，取此液離心10分鐘，分取上清液，即得。
4、陰性樣品溶液的制備
   取缺黃芩的模擬制劑約10g按供試品溶液的制備方法依法測定，結果表明：陰性樣品的HPLC圖譜中，無呈現與黃芩苷對照品保留時間相同的色譜峰。
5、測定法
   分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀測定含量，以峰面積積分按外標法計算。

四、線性關系考察
    精密吸取對照品溶液（濃度為：0.050mg/ml）2、4、6、8、10、12，依次進樣，以進樣量（μg）對峰面積進行線性分析，方程為Y=100135.548X-117.256，r=0.9945，結果表明黃芩苷在0.1000-0.6000mg間成良好的線性關系。
  
五、精密度試驗
    精密吸取上述對照品溶液，連續進樣6次，每次10μl，測定峰面積積分值，結果RSD為0.96%。
　
六、穩定性試驗
    精密吸取上述對照品溶液，在0、2、4、6、8小時進樣，共5次，每次10μl，測定峰面積積分值，結果RSD為0.80%，表明黃芩苷在8小時內穩定。
  
七、重復性試驗
    取同一批號樣品，按供試品溶液制備方法制備用6個測定結果進行評價（n=6），按正文含量測定項下色譜條件測定，結果RSD為 1.21%。
  
八、回收率試驗
    取已測之含量的樣品，平行6份，分別精密加黃芩苷對照品適量，按供試品制備方法制備和測定，計算6次的回收率，結果見表2；表2  回收率測定結果（略）

九、討論
1、含量測定中選擇色譜條件時，曾對流動相包括溶劑系統組成和比例進行了研究，，根據參考文獻對多種溶劑的選擇：（1）甲醇-水-磷酸（43：57：0.2）；（2）乙腈-水-冰醋酸（50：50：1）；（3）甲醇-水-冰醋酸（50：50：1）；甲醇－0.2mol/L磷酸二氫鈉緩沖液（用磷酸調節pH值至2.7）（42：58），根據分離情況，選擇甲醇－0.2mol/L磷酸二氫鈉緩沖液（用磷酸調節pH值至2.7）（42：58），流速1ml/min。
2、曾對樣品的提取方法進行考察，分別采用甲醇回流提取1h，甲醇提取0.5小時、50%甲醇、10%甲醇超聲提取3種提取方法，經測定10%超聲提取的效果好。
3、對提取工藝研究，以上三味，分別加水煎煮二次，*次1.5小時，第二次1小時，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度約為1.25（70℃），噴霧干燥成干浸膏粉；將上述三種浸膏粉加入適量蔗糖與糊精，混勻，制成顆粒，干燥即得，此方法提取效果優于以往三藥混合煎煮，而且含量高。

相關產品信息：Hypersil,Kromasil,廣州氣相色譜儀,色譜標準品,inertsil